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ELISA實(shí)驗(yàn)之"OD值"？
“OD值”這個(gè)概念想必做實(shí)驗(yàn)的各位小伙伴們都不陌生，從判斷提取核酸的質(zhì)量及濃度，到BCA蛋白定量進(jìn)行蛋白定量，又或者是ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的蛋白含量，這些常用的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)都需要檢測(cè)樣品的“OD值”，但是，“OD值”到底是什么，我們?cè)跍y(cè)量“OD值”的時(shí)候又有哪些需要注意的問(wèn)題，今天就讓小編給小伙伴們好好說(shuō)道說(shuō)道。什么是“OD”值？
OD全稱(chēng)optical density，也就是光密度，也可以稱(chēng)為吸光度。吸光度指的是利用物質(zhì)特有的吸收光譜，來(lái)鑒別物質(zhì)或者測(cè)定物質(zhì)的含量，也就是將一束特定波長(zhǎng)的光通過(guò)被檢測(cè)物，被檢測(cè)物可以將光吸收掉一部分，通過(guò)吸光度計(jì)算被檢測(cè)物的濃度。一般被檢測(cè)物濃度越高，吸光度的值就會(huì)越高。實(shí)驗(yàn)中也是利用“OD值”和被檢測(cè)物的濃度之間的關(guān)系來(lái)根據(jù)吸光度。
測(cè)量“OD值”注意事項(xiàng)：
最需要注意的就是測(cè)量時(shí)的光波長(zhǎng)。吸光度利用的是物質(zhì)特有的吸收光譜，實(shí)際操作中我們需要注意的最關(guān)鍵的也是這一點(diǎn)，不同物質(zhì)的吸收光譜不同，最大吸收峰的波長(zhǎng)也不同，為了達(dá)到最好的測(cè)量效果，一般來(lái)講，我們需要在待測(cè)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)處來(lái)檢測(cè)其“OD值”。例如，核酸在260nm波長(zhǎng)處光吸收最大，而蛋白和酚類(lèi)物質(zhì)則在280nm波長(zhǎng)處光吸收最大；BCA法檢測(cè)蛋白含量時(shí)，顯色反應(yīng)后，溶液由淺綠色變?yōu)樽仙?，此時(shí)在560nm處有最大光吸收值；TMB法顯色的ELISA實(shí)驗(yàn)，在加入終止液后溶液由藍(lán)色變?yōu)辄S色，在450nm處有最大光吸收。
對(duì)于測(cè)量得到的待測(cè)樣本“OD值”還需要進(jìn)行換算才可以得到最終的濃度，有很多小伙伴往往在這一步出現(xiàn)錯(cuò)誤，功虧一簣。需要注意的地方也比較簡(jiǎn)單，就是根據(jù)對(duì)應(yīng)試劑盒的說(shuō)明書(shū)，采用推薦的曲線擬合方式進(jìn)行擬合，擬合后需要看一下擬合曲線的R2值，約接近1證明曲線擬合度越高，結(jié)果越可信。如果R2值較低，則需要檢查是否出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋問(wèn)題或?qū)嶒?yàn)操作出現(xiàn)失誤。
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