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實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想？做好這幾點(diǎn)你就是ELISA大神
Elisa實(shí)驗(yàn)是一種敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)診斷方法。由于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡便，結(jié)果判斷較客觀等因素，已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗(yàn)的各領(lǐng)域中。ELISA檢測試劑盒適用于體外定性檢測人血清或血漿中的抗人類戊型肝炎(HEV)病毒 IgM 抗體ELISA檢測。ELISA法由于操作簡略，已被廣泛應(yīng)用，今天咱們就來談?wù)凟LISA試劑盒需把握的關(guān)鍵有哪些？
1.在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。一切試劑瓶蓋須蓋緊以避免蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致呈現(xiàn)錯誤的結(jié)果。
2.小心汲取試劑并嚴(yán)格遵守給定的孵育時刻和溫度。請注意在汲取標(biāo)本/規(guī)范品，酶結(jié)合物或底物時，第一個孔與最后一個孔加樣之間的時刻距離假如太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時刻，然后明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。
3.試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃，部分試劑保存于2-8℃，具體以標(biāo)簽上的標(biāo)示為準(zhǔn)。
4.濃洗滌液會有鹽分出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
5.剛敞開的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會對試驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。
6.一切的樣品都應(yīng)管理好，依照規(guī)則的程序處理樣品和檢測設(shè)備。
通常我們可用于ELISA檢測的樣本是有多種類型的，如血清、血漿、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清或組織勻漿液等，不同類型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。正確的處理樣本是保證ELISA檢測的正確性和準(zhǔn)確性的第一步，下面簡單介紹一下細(xì)胞裂解液樣本及組織勻漿樣本的正確采集、處理方法。
細(xì)胞裂解液：
1.吸去培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基，用胰酶消化細(xì)胞，加適量培養(yǎng)基將細(xì)胞從培養(yǎng)板上吹下來。懸浮細(xì)胞可省略。
2.收集細(xì)胞懸液，1000×g離心10min，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS潤洗3次。
3.加入適量的預(yù)冷PBS或細(xì)胞裂解液（臨用前加入蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞。通常6孔板一個孔的細(xì)胞量需要150~250μL PBS重懸。
4.將樣品放入-20℃或-80℃，使樣品冷凍，再放室溫解凍樣品，反復(fù)凍融幾次，使細(xì)胞充分裂解。也可將樣品進(jìn)行超聲破碎，以達(dá)到裂解的目的。
5.4℃10000×g 離心10min，除去細(xì)胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
組織勻漿液：
1.將組織樣本用PBS (0.01M, PH 7.4) 沖洗，洗去組織表面殘留的血液或雜質(zhì)。
2.將組織塊稱重，記錄后剪碎，碎塊應(yīng)盡量小，便于勻漿得更充分。
3.將組織按一定的比例加入預(yù)冷的PBS（臨用前加入蛋白酶抑制劑）勻漿，勻漿時置于冰上或冰浴中。（通常按組織重量：PBS體積=1:9的比例勻漿，例如1g的組織樣本對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，檢測后計(jì)算樣品濃度時應(yīng)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)）。
4.吸取勻漿液到離心管，4℃5000×g 離心5~10min，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
注意：保證樣本不含NaN3，因?yàn)镹aN3會抑制HRP的活性，從而導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。
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