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酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(ELISPOT)
ELISPOT法源自ELISA，又突破傳統(tǒng)ELISA法，是定量ELISA技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。
從單細(xì)胞水平觀察分泌蛋白的表達(dá)已成為目前研究細(xì)胞功能的重要內(nèi)容，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISpot)技術(shù)巧妙地運(yùn)用了酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，從方法上解決了該難題，已廣泛運(yùn)用于各項(xiàng)重要課題研究中。ELISpot最初用于檢測(cè)分泌抗原特異性抗體的個(gè)體B細(xì)胞，以后該方法不斷改進(jìn)，用于檢測(cè)分泌特定抗原的單個(gè)細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)方法原理：
ELISPOT技術(shù)原理，一句話(huà)概括就是：用抗體捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色的方式將其表現(xiàn)出來(lái)。
實(shí)驗(yàn)材料：
1.細(xì)胞
2.70％乙醇 、PBS、 脫脂奶粉 、鏈霉親和素 、檢測(cè)抗體、 包被抗體
3.PVDF膜、 96孔培養(yǎng)板 、硝基纖維素底板、 免疫斑點(diǎn)板、 酶標(biāo)板
實(shí)驗(yàn)步驟：
一、包被96孔板
1.用70％乙醇浸潤(rùn)96孔板中的PVDF膜30 s
2.加入捕獲抗體（PBS稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜
3.倒空板中包被液，輕輕在紙上拍干，用PBS洗滌，禁用洗板機(jī)
4.加入100ul 2%的脫脂奶粉（或者BSA）室溫孵育2小時(shí)，封閉板中空白位點(diǎn)
5.PBS洗滌1次。（如果暫時(shí)不用，可將96孔板干燥后4保存，可保存2周以上）
二、細(xì)胞刺激和細(xì)胞因子捕獲
從新鮮血液中用Ficoll分離PBMC并進(jìn)行計(jì)后，將細(xì)胞用培養(yǎng)液稀釋后加入96孔板中。細(xì)胞數(shù)量需要優(yōu)化，最好進(jìn)行備比稀釋以確定合適的細(xì)胞數(shù)量。通常所用細(xì)胞數(shù)量為1-2×105/孔。
將96孔板在37℃ CO2孵箱中孵育過(guò)夜。禁止移動(dòng)或晃動(dòng)板子。
用含0.1% Tween 20 的PBS孵育10分鐘，去除細(xì)胞和未結(jié)合的細(xì)胞因子。然后用含0.1% Tween 20 的PBS洗滌3次。 禁用洗板機(jī)。
三、加入檢測(cè)抗體檢測(cè)
加入標(biāo)記的檢測(cè)抗體（用含1％BSA的PBS稀釋?zhuān)?，室溫孵?-2小時(shí)。
加入底物顯色（如果檢測(cè)抗體為酶標(biāo)）或者熒光直接檢測(cè)（如果檢測(cè)抗體是熒光標(biāo)記）：在加入底物之前用蒸餾水洗滌板子膜的兩側(cè)，以防止部分溶液漏出后導(dǎo)致的背景。監(jiān)測(cè)斑點(diǎn)的形成，適時(shí)終止反應(yīng)。
用蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。
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