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恒遠(yuǎn)小課堂:您了解結(jié)合物嗎?
結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISA中至關(guān)重要的關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應(yīng)該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結(jié)合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤?，在結(jié)合試劑中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原），此外，結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。
用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：
①純度高
②催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高
③專(zhuān)一性強(qiáng)
④性質(zhì)穩(wěn)定
⑤來(lái)源豐富
⑥價(jià)格不貴
⑦制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保存它的活性部分和催化能力
⑧在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶
⑨相應(yīng)底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等
在ELISA中，常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶。在少數(shù)商品ELISA試劑中，應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。國(guó)產(chǎn)ELISA試劑一般都用HRP制備結(jié)合物。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶無(wú)色糖蛋白在275nm波優(yōu)點(diǎn)有高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm波優(yōu)點(diǎn)有高吸收峰。HRP的純度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意為純度數(shù)）表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ≥7.0。
HRP除符合上述的ELISA中標(biāo)記酶的要求外，更有價(jià)格低廉和性質(zhì)較穩(wěn)定的特點(diǎn)。值得留意的是，在選用酶制劑時(shí)，除其純度RZ外，更應(yīng)留意酶的活力。高純度的酶如保存不當(dāng)，活力也會(huì)降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示，可用對(duì)底物作用后天生產(chǎn)物量的測(cè)定進(jìn)行試驗(yàn)。
國(guó)外很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標(biāo)記酶。常用的AP有兩個(gè)來(lái)源，分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。不同來(lái)源的酶生化特性特性略不相同，從大腸桿菌中提取的AP分子量為80000，酶作用的適合pH為8.0；用小牛腸膜中提取的AP分子量為100000，適宜pH為9.6。在ELISA中，AP系統(tǒng)的敏感度一般高于HRP系統(tǒng)，空缺值也較低，但AP價(jià)格昂貴，制備結(jié)合物所得率也較HRP低。
制備結(jié)合物時(shí)所用抗體一般 均為純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。用親和層析純的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。如用F(ab)2進(jìn)行標(biāo)記，則更可避免標(biāo)本中RF的干擾。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式未幾，總的要求是抗原必須是高純度的。
用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加進(jìn)高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)（例如1%牛血清白蛋白），通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)以抑制結(jié)合物的吸附。一般還加進(jìn)具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20，0.05%的濃度較為適宜。在間接測(cè)定抗體時(shí)，血清標(biāo)本需稀釋后進(jìn)行測(cè)定，也可應(yīng)用這種稀釋液。
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