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實驗筆記之ELISA實驗常見問題解答
1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標抗體技術(shù)發(fā)展成液體標本中微量物質(zhì)的測定方法。這一方法的基本原理是：①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺有無定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。
ELISA實驗原理簡單，步驟少，流程短，試劑盒操作相對簡便，實驗小白也能輕松上手。然而，實驗上手雖快，想要得到可靠的實驗結(jié)果，卻并不那么容易。為了更好地助力科研實驗，恒遠生物在這里將大家關(guān)心的ELISA試劑盒實驗的常見問題整理如下：
一、關(guān)于試劑盒：
1.你們的ELISA試劑盒能檢測什么物種？
目前我們的試劑盒檢測的種屬主要為人、小鼠、大鼠、猴、兔、豬、雞、植物等，種屬齊全。如果試劑盒的命名帶有特定指向（如人），代表專門針對此物種；沒有指明物種，則代表該試劑盒在目前公司產(chǎn)品涉及的種屬（例如人、小鼠、大鼠、猴、兔等）內(nèi)通用；其他特殊種屬的檢測適用性，請聯(lián)系技術(shù)支持確認。
2.96TELISA試劑盒能檢測多少樣本？是否需要做復孔？
為了保證實驗結(jié)果的準確性，我們建議標準品和樣品都做復孔，但并不強行要求ELISA實驗一定要做復孔/3復孔，客戶可根據(jù)自己的需求設(shè)定復孔實驗，具體實驗情況可咨詢恒遠生物技術(shù)指導。
3.需檢測的樣品較多，能否減少標曲的孔數(shù)？
為保證結(jié)果的準確度，不建議減少標曲的孔數(shù)，請確保能夠檢測至少6個不同的標準品濃度（含空白孔)。
4.ELISA試劑盒要使用多次，但樣本較多，是否可以只做一次標曲？
雖然ELISA實驗的操作步驟相同，但每次實驗的各種影響因素都會有所變化。所以，每次實驗時，都必須重新繪制標準曲線，以得到更準確可靠的檢測結(jié)果。如果需要做多次實驗，溶解后的最高濃度標準品可以分裝保存于-20℃條件下，避免反復凍融，半個月內(nèi)使用有效。
二、關(guān)于樣本
1.血清血漿樣本應(yīng)該選用哪種真空采血管收集？
血清：不含抗凝劑的采血管/含促凝劑采血管（通常為紅色、黃色、橘色管蓋的采血管）
血漿：含抗凝劑的采血管（通常為綠色、紫色管蓋的采血管）
樣品收集后，若在1周內(nèi)進行檢測，可保存于2-8℃條件下；若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃條件下（1個月內(nèi)檢測）或-80℃條件下（3個月內(nèi)檢測），避免反復凍融。檢測前，應(yīng)緩慢融化冷凍過的樣本，并離心除去凍融過程中產(chǎn)生的沉淀物。
2. 采集時，如何盡可能避免溶血現(xiàn)象？
溶血可由多種理化因素和毒素引起。在體外，機械性強力振蕩、低溫冷凍等誘因均可引起溶血。為避免溶血對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，應(yīng)注意：
（1）靜脈采血時，回抽壓力不宜過大；
（2）一次性采血量不宜過少；
（3）采集的全血不宜激烈振蕩；
（4）離心轉(zhuǎn)速不宜過大；
（5）收集的全血需盡快處理成血清/血漿，全血不能凍融；
（6）若需要麻醉采血，需使用沒有溶血作用的麻醉劑。
3.組織/細胞樣本收集中提到的“反復凍融”，過程應(yīng)該如何操作？
（1）組織樣本：組織研磨后，將其-80℃放置1h/液氮放置0.5h，再置于30℃水浴鍋中輕微振蕩，使其迅速融化，反復操作1-2次即可；
（2）細胞樣本：按上述操作步驟，反復凍融2-3次。若為膜蛋白，可以適當做超聲處理，但需要控制好超聲的溫度、頻率；
4.怎樣判斷我的樣本是否需要稀釋或做其他處理？
試劑盒的檢測范圍不等同于樣本中待測物的濃度范圍，建議實驗前通過相關(guān)文獻預估樣本中待測物的濃度，并通過預實驗確定樣本的實際濃度情況。如果是常規(guī)樣本類型，可以咨詢ELISA技術(shù)支持，以獲取樣本的推薦稀釋倍數(shù)，并安排預實驗檢測；如果樣品中待測物的濃度過高或過低，請對樣本做適當?shù)南♂尰驖饪s；如果樣本中的分析物濃度遠低于試劑盒的最低檢測限，建議選擇靈敏度更高的試劑盒來檢測。